Preparation and Extraction of Genomic DNA: जीनोमिक डीएनए, आनुवंशिक सामग्री जो किसी जीव के निर्माण और रखरखाव के लिए निर्देश देती है, विभिन्न आणविक जीव विज्ञान तकनीकों में एक महत्वपूर्ण घटक है। विभिन्न जैविक नमूनों से इसका निष्कर्षण कई अनुसंधान और नैदानिक अनुप्रयोगों में एक आवश्यक कदम है। जीनोमिक डीएनए की तैयारी और निष्कर्षण में सेलुलर संरचनाओं को बाधित करने, डीएनए को अन्य सेलुलर घटकों से अलग करने और निकाले गए डीएनए को शुद्ध करने के उद्देश्य से कई चरण शामिल हैं।
नमूने तैयार करना
डीएनए निष्कर्षण से पहले, डीएनए की रिहाई की सुविधा के लिए रुचि का नमूना तैयार किया जाता है। इसमें सेलुलर सामग्री को मुक्त करने के लिए कोशिकाओं का समरूपीकरण या विघटन, प्रोटीन और अन्य सेलुलर घटकों का एंजाइमेटिक पाचन, और कोशिकाओं को नष्ट करने और डीएनए को घुलनशील करने के लिए रसायनों के साथ उपचार शामिल हो सकता है।
निष्कर्षण तकनीक
जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण के लिए विभिन्न तकनीकों का उपयोग किया जाता है, जिनमें से प्रत्येक के अपने फायदे और सीमाएं हैं। सामान्य तरीकों में शामिल हैं:
साल्टिंग-आउट विधि: यह विधि डीएनए को घुलनशील छोड़ते हुए प्रोटीन और अन्य सेलुलर घटकों को अवक्षेपित करने के लिए उच्च नमक सांद्रता का उपयोग करती है।
कार्बनिक निष्कर्षण: यह विधि कार्बनिक और जलीय चरणों में उनकी अंतर घुलनशीलता के आधार पर अन्य सेलुलर घटकों से डीएनए निकालने के लिए फिनोल और क्लोरोफॉर्म जैसे कार्बनिक सॉल्वैंट्स का उपयोग करती है।
एंजाइमैटिक लाइसिस: यह विधि प्रोटीन और अन्य सेलुलर घटकों को पचाने के लिए एंजाइमों का उपयोग करती है, जैसे कि लाइसोजाइम और प्रोटीनेज के, जिससे डीएनए बरकरार रहता है।
चुंबकीय मनका-आधारित अलगाव: यह विधि नमूने से डीएनए को पकड़ने और अलग करने के लिए विशिष्ट डीएनए-बाध्यकारी अणुओं के साथ लेपित चुंबकीय मोतियों का उपयोग करती है।
निकाले गए डीएनए का शुद्धिकरण
निष्कर्षण के बाद, शुद्ध डीएनए को आरएनए, प्रोटीन और लवण जैसे किसी भी शेष संदूषक को हटाने के लिए आगे के चरणों के अधीन किया जाता है। सामान्य शुद्धि विधियों में शामिल हैं:
इथेनॉल अवक्षेपण: इथेनॉल की उच्च सांद्रता का उपयोग करके समाधान से डीएनए अवक्षेपित किया जाता है।
कॉलम क्रोमैटोग्राफी: डीएनए को विशेष राल से भरे कॉलम के माध्यम से पारित किया जाता है जो डीएनए को चुनिंदा रूप से बांधता है और इसे अन्य घटकों से अलग करता है।
डीएनए यील्ड और शुद्धता का निर्धारण
निकाले गए डीएनए की मात्रा और शुद्धता डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है। डीएनए की सांद्रता आमतौर पर 260 एनएम पर प्रकाश के अवशोषण को मापकर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री का उपयोग करके निर्धारित की जाती है। शुद्ध डीएनए लगभग 1.8 का ए260/ए280 अनुपात प्रदर्शित करता है, जो प्रोटीन या आरएनए द्वारा न्यूनतम संदूषण का संकेत देता है।
यूवी अवशोषण विधि
यूवी अवशोषण विधि डीएनए एकाग्रता और शुद्धता दोनों को निर्धारित करने के लिए एक सरल और व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक है। इस विधि के पीछे सिद्धांत यह है कि डीएनए 260 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर पराबैंगनी प्रकाश को अवशोषित करता है। डीएनए समाधान का अवशोषण उसकी सांद्रता के सीधे आनुपातिक होता है। 260 एनएम पर डीएनए समाधान के अवशोषण को मापकर, समाधान में डीएनए की एकाग्रता का अनुमान लगाया जा सकता है।
डीएनए की शुद्धता यूवी अवशोषण विधि का उपयोग करके भी निर्धारित की जा सकती है। प्रोटीन और आरएनए भी पराबैंगनी प्रकाश को अवशोषित करते हैं, लेकिन डीएनए से भिन्न तरंग दैर्ध्य पर। 260 एनएम और 280 एनएम दोनों पर डीएनए समाधान के अवशोषण को मापकर, कोई ए260/ए280 अनुपात की गणना कर सकता है। लगभग 1.8 का अनुपात शुद्ध डीएनए को इंगित करता है, जबकि कम या अधिक अनुपात क्रमशः प्रोटीन या आरएनए द्वारा संदूषण का संकेत देता है।
डीएनए निष्कर्षण के अनुप्रयोग
जीनोमिक डीएनए का निष्कर्षण विभिन्न आणविक जीव विज्ञान तकनीकों में एक आवश्यक कदम है, जिसमें शामिल हैं:
पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर): जीन का पता लगाने, क्लोनिंग और अनुक्रमण के लिए डीएनए प्रवर्धन।
प्रतिबंध एंजाइम पाचन: विश्लेषण और हेरफेर के लिए डीएनए को विशिष्ट टुकड़ों में काटना।
दक्षिणी धब्बा संकरण: एक नमूने में विशिष्ट डीएनए अनुक्रमों का पता लगाना।
जीनोटाइपिंग: किसी व्यक्ति या जीव की आनुवंशिक संरचना का निर्धारण करना।
डीएनए क्लोनिंग: अनुसंधान या जैव प्रौद्योगिकी उद्देश्यों के लिए विशिष्ट डीएनए अंशों की प्रतियां बनाना।
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